Am o nelamurire,va rog sfatuiti-ma!!!

MedLive.ro a patruns in laboratorul MedLife si a urmarit, pas cu pas, drumul probelor de analiza, de la recoltare pana la rezultatele finale. In episodul IV, dr. Claudia Nica, medic-sef Laborator MedLife explica modul de prelucrare a exsudatului faringian, in cadrul departamentului de bacteriologie.

Primul pas este trierea, unde proba primeste un numar de ordine, care faciliteaza accesul medicilor la rezultate. “Aceasta pozitie, se regaseste in registrele de lucru de la bacteriologie si usureaza citirea a doua zi de catre medic”, explica dr. Nica.
Urmeaza insamantarea probei pe medii de cultura. “In cazul exsudatului faringian se analizeaza geloza, sange si Saburo. Alte culturi se insamanteaza pe alte medii de cultura specifice probei respective. Dupa ce s-a facut insamantarea, proba se pune la termostat unde sta 24 de ore. Dupa 24 de ore se face o prima identificare pe sange. Cele pe Saburo se tin 48 de ore“.
Exsudatul faringian

Apoi, specialistii urmaresc dezvoltarea bacteriilor patogene, precum streptococul beta hemolitic si stafilococul auriu. Rezultatele semnaleaza si prezenta bacililor, care este relevanta numai in cazul pacientilor imunodeprimati sau cu situatii speciale.
Pe Saburo se urmareste prezenta levurilor, care sunt un tip de fungi, implicati frecvent in infectii cutaneo-mucoase si stemice (micoze). Levurile cuprind numeroase specii, dar genurile implicate cel mai frecvent in infectii la om sunt: candida, cryptococcus, histoplasma, malassezia. Acestea au o dezvoltare mai lenta, de aceea se tin la termostat 48 de ore.
In cazul in care exista o cultura pura, din care se poate face imediat antibiograma si identificarea, se face acest lucru. In cazul in care nu este o cultura pura, sunt colonii izolate, acestea sunt repicate, deci se trec inca o data pe mediul de cultura. Se face o repicare ca sa obtinem o cultura imbogatita si pura, din care apoi, a doua zi, pentru ca si aceasta are nevoie de 24 de ore de crestere la termostat, la 37 de grade Celsius, se face antibiograma identificarea la streptococ de grup din cultura pura”, spune dr. Nica.
“La 48 de ore se urmareste prezenta sau absenta levurilor, se face si antifungigrama si se dau apoi in rezultatul final, de exemplu: streptococ beta hemolitic de grup A – prezent, candida – frecvente colonii”.
“Exista metode automatizate dar acestea nu exclud incubarea, deci oricum si acestea au nevoie de insamantare pe medii de cultura. Nu se poate face nimic automat din tamponul cu care s-a recoltat”, a explicat dr. Nica.
Redactia MedLive.ro

Cultura microbiana
Cultivarea patogenilor se face prin plasarea acestora intr-un mediu nutritiv, care sa le permita multiplicarea. Succesul acestei metode depinde de corectitudinea procedeului de recoltare si transport al probei biologice. Atunci cand exista dubii in privinta modalitatii corecte de recoltare, clinicianul va cere sfatul laboratorului de microbiologie.

Un mediu de cultura artificial, realizat in laborator este format dintr-o substanta suport = agar (geloza sau jeleu), care nu este metabolizata de bacterii, dintr-o substanta nutritiva care intretine multiplicarea patogenilor si din substante cu rol in inhibarea cresterii altor microorganisme; ,,bulionul’’ astfel preparat este asezat pe placile de cultura fabricate dintr-o sticla speciala. Dupa caz, pot fi cutivate toate bacteriile din proba biologica sau, prin utilizarea substantelor antimicrobiene, pot fi selectate pentru crestere, doar acele bacterii considerate a fi implicate in producerea infectia. Dupa pregatirea si insamantarea mediului de cultura acesta este supus procesului de incubatie. Iar dupa formarea coloniilor bacteriene, placile de cultura vor fi analizate pentru indentificarea bacteriilor patogene.
Agentii virali pot fi de asemenea, izolati prin cultura, atunci cand nu putem pune in evidenta prezenta anticorpilor serici sau modificarea titrului acestora (variatia concentratiei de anticorpi), ca urmare a unei infectii. Pentru amplificarea si detectarea virusului se utilizeaza o cultura de celule etalate intr-un singur strat, provenite de la un mamifer; aceste celule sunt astfel alese incat sa poata fi infectate de agentul viral suspectat. Celulele animale din cultura permit replicarea virala (pentru inmultire, un virus are nevoie de o gazda vie). Ulterior, virusul va fi detectat datorita efectelor citopatice asupra celulelor din cultura sau cu ajutorul metodei imunofluorescente. Un virus care se raspandeste rapid de la o celula la alta (virusul citomegalic, herpes simplex) poate fi detectat mult mai usor intr-o astfel de cultura.
METODE DE IDENTIFICARE A AGENTILOR PATOGENI CULTIVATI

Rezultatul insamantarii si incubarii placilor de cultura, il reprezinta formarea coloniilor bacteriene, favorizata de existenta mediului nutritiv artificial creat. Pasul urmator il reprezinta identificarea patogenilor care au format colonii. Identificarea se face tinand cont de caracterele fenotipice: dimensiunea coloniilor, culoarea coloniilor, reactia de hemoliza (liza a eritrocitelor), mirosul. De asemenea, se va tine cont de posibilitatea unor bacterii de a forma prin cultivare produsi finali specifici, dar si de aspectul microscopic al acestora.

Sistemele automatizate pot identifica patogenii, pe baza caracteristicilor fenotipice, in cateva ore (biotipare automata). Pentru accelerarea procesului de identificare, unele sisteme utilizeaza enzime performante, capabile sa converteasca substratul analizat in produse finale mai usor de identificat.
Cromatografia cu gaz-lichid este utilizata pentru identificarea produsilor finali, rezultati in urma procesului de fermentatie bacteriana. Procedeul permite identificarea acizilor grasi cu lant scurt rezultati in urma precesului de fermentatie a glucozei. Tipurile de acizi volatili si concentratia acestora difera functie de specia de microorganism anaerob care realizeaza fermentatia, permitand identificarea chiar si a speciilor strans inrudite. Rezultatele pot fi obtinute in decurs de cateva ore dupa formarea coloniilor. Metoda cromatografica de analiza a acizilor grasi cu lant lung este una dintre cele mai utilizate in laboratorul de microbiologie, pentru caracterizarea fenotipica a patogenilor.
Sondele de acizi nucleici permit diagnosticul infectiilor bacteriene, virale sau fungice, pe baza detectiei secventelor de ADN / ARN specifice patogenilor.

Tehnica consta in punerea in evidenta a unei secvente scurte de ADN / ARN bacterian prin cuplarea cu o molecula complementara, utilizata ca semnal pentru detectie. Procedeul implica liza celulelor bacteriene, urmata de denaturarea prin caldura a lanturilor de ADN / ARN cu obtinerea de molecule monocatenare (ADN-ul este in mod normal dublu catenar = format din doua lanturi de nucleotide complementare). Dupa ce ,,sonda’’ a hibridizat cu molecula tinta de ADN mococatenar, se folosesc diferite tehnici pentru detectarea si amplificarea semnalului biologic sonda-ADN monocatenar. Unele sonde permit identificarea ADN-ului bacterian iar altele pe cel de origine virala (papilloma virus).
Sensibilitate si specificitatea metodelor ce utilizeaza sondarea cu acizi nucleici este comparabila cu cea a metodelor traditionale (culturi sau EIA). Pentru o mai buna acuratete a rezultatelor, atat ADN-ul tinta cat si sondele, pot fi amplificate prin metodele de polimerizare in lanta (PCR). Metoda are anumite limite, deoarece in timpul procesului de amplificare se poate face contaminarea cu ADN sau ARN provenit din alte surse bacteriene sau virale, care va conduce la obtinerea unor rezultate fals pozitive.
Tehnica de sondare cu acizi nucleici este foarte utila in identificarea unor specii bacteriene cu crestere dificila, cum ar fi speciile de Mycobacterium (agentul etiologic al tuberculozei). De asemenea, agentii virali pot fi identificati mult mai repede decat prin metodele de cultivare ,,in vitro’’. Datorita costurilor ridicate si a echipamentului complex (in comparatie cu metodele clasice), procedeul de indetificare a ADN / ARN-ului patogen nu poate fi aplicat in toate laboratoarele de microbiologie.